Demande de technique

Serait-il possible de nous communiquer vos techniques de congélation en DMSO ou autre (-80° ou azote liquide) de cellules amniotiques ou fibroblastes après culture en vue de la conservation de cellules vivantes? Merci d'avance de votre participation.

Salut , j'ai trouvé ça, c'est une technique qui marchait bien, mais que l'on n'utilise plus depuis la mort prématurée de notre congélateur à -80° !

REACTIFS ET MILIEUX
Trypsine-EDTA (GIBCO cat n° 25300-054)- Stockée à -20°C (peut être aliquotée par 3 ou 6 ml)

DMSO (SIGMA ref 00932): Diméthyl sulfoxide, stocké à température ambiante (durée illimitée)

Milieux de culture :

CHANG D (Irvine Scientific). A préparer comme suit :
500 ml CHANG D (stocké à –20°C)
+ 4,25 ml de Pénicilline/Streptomycine (Eurobio).

Amniochrom - II (BioWhittakerä). A préparer comme suit :
Basal medium-500 ml - conservé à 4°C
Supplement- 35 ml - conservé à -20°C



CONGELATION DES CELLULES

Choisir un flacon de culture presque à confluence.
Décongeler ~ 10 ml de solution Trypsine-EDTA à 4°C ou à température ambiante (mais veiller à ce qu’elle soit froide au moment de son utilisation).

Vider totalement le flacon de son milieu de culture, le rincer en recouvrant d’un film de trypsine-EDTA (~ 3 ml) et vider aussitôt.

Recouvrir la culture d’un nouveau film de trypsine-EDTA (3 ml) et placer le support à l’étuve à 37°C pendant quelques minutes (~ 5 à 10 min) pour activer l’enzyme et permettre le décollement cellulaire. Tapoter éventuellement avec le plat de la main le fond du support de temps en temps tout en surveillant le décollement au microscope inversé.

Lorsque le tapis cellulaire est décollé, transvaser la suspension dans un tube à centrifuger stérile à fond conique et ajouter 3 ml de milieu de CHANG D.

Centrifuger 10 min à 1000 trs/min.
Aspirer tout le surnageant.
Reprendre le culot par 1 ml de sérum de veau fœtal.
Transvaser le mélange dans un cryotube contenant 0,1 ml de DMSO, agiter, le placer dans de la glace pilée puis rapidement à – 80°C (DMSO toxique pour les cellules).



DECONGELATION

Placer le tube congelé dans une étuve à 37°C.

Aussitôt décongelé, remettre en culture en flacon ou en Labtek (selon les besoins)selon le schéma suivant :

- verser dans un flacon de culture contenant 2 ml de milieu Amniochrome II. Remettre à l’étuve 37°C, 5% de CO2.

- Verser dans un flacon de culture contenant 2 ml de milieu CHANG D : après homogénéisation, répartir dans deux LabTeks (1,5 ml/ LabTek). Remettre à l’étuve 37°C, 5% de CO2.


Attendre 24 à 48 heures l’accrochage des cellules avant un nouveau changement de milieu.

Toute congélation / décongélation doivent être consignées sur le cahier de congélation

MERCI POUR LA TECHNIQUE NOUS ALLONS L'ESSAYER DANS LES PROCHAINS JOURS

bonjour
je suis technicienne de laboratoire de genetique de chu de fes.
je vous ecris pour savoir si vous avez un protocol des bandes G qui marche bien
merci

Salut
On utilise cette technique sur les sangs, on est assez contant:

- Vieillissement des lames 30min à 100°C ( ou 1 nuit à 37°C)
- Tramper dans Trypsine 250 ( Difco : 1.5g pour 1 litre) pdt 35 à 40 secondes
- 2 bains trés (trés) rapide de PBS
- Coloration 3 à 4min dans mélange: - Giemsa 3ml
- Acide Citrique (0.1M) 4ml
- méthanol 3ml
- Na2HPO4 (0.2M ) 8ml
- Qsp 100ml avec eau distil.
Attention ce colorant ne ce conserve que 20 minutes environs ...!
Les temps indiqués peuvent étre trés variable ( du simple au double voir plus ) il est conseiller de faire une gamme ... Voila

bonsoir
merci bcp pour la reponse ...mais est ce que vous pouvez me dire pourquoi l'acide acitrique et metanol ?????!!!!! et comment on l'utilise au cours de cette technique??!!! l'acide acitriq et metanol(fixateur) normalement on les prepare a l'etape de fixation avant de faire le marquage soit par les bandes G ou R!!! n'est ce pas ???!!!
merci

Salut
Attention de ne pas confondre l'Acide Acéthique que l'on utilise effectivement avec le méthanol ( 1/4 ; 3/4) pour faire du fixateur , et l'Acide Citrique ( ...du citron ) que l'on met dans la préparation de ce colorant . Disons qu'une coloration au giemsa seule ne convient pas, il faut préparer un nouveau colorant avec les produits que je t'ai donnés.
J'avais oublié, la température de la trypsine peut être importante, nous l'utilisons entre 22 et 25°C, ...24 c'est parfait.
Bon courage

bonjour
svp je veux savoir le temps exacte de les lames ds la trypsine cad chaque jours a son temps si c'est possible bien sur ,parceque j'ai fait tous ce que tu m'a dis mais les bandes n'apparait pas bien il y a encore qlq chose qui manque
merci

Salut.
Dans les conditions que je t'ai données, nous les laissons 35 secondes et 40 secondes, ce sont toujours à peut prés les mêmes temps, mais c'est trés rapide et ne laisse pas beaucoup de marges d'erreurs. Mais ces temps peuvent êtres très variable, n'hésite pas à faire une gamme de 10secondes à 2 ou 3 minutes pour bien cerner le temps qui convient chez vous. Espace les temps de 10secondes(plutot 5s) pas plus, car 10s de trop et ce serat illisible.
Autre point important on n'utilise la trypsine qu'une fois, aprés reconstitution on l'allicotte et la congel, on la décongel à température ambiante qqs heure avant utilisation. Sinon quoi d'autre ??? Le rinçage dans le PBS doit être vraiment rapide ( à peine 1seconde)...
tiens moi au courant ... bon courage

bonjour
j'ai trouvé le temps exacte de l'apparaition des bandes G, c'est 15s (j1) mais les mitoses sont deformés au cours de cette technique ...est ce que vous savez pourquoi ???

Salut
Tout dépend de ce que tu appel "déformées" ...?
Chez nous les chromosomes apparaissent toujours un peu plus allongés qu'en bande R , mais à la limite , ce n'est pas plus mal.
Ca viens peut être du passage à 100°C pdt 30 min ...???

salut
moi je laisse normalement les lames une nuit @ 37° est pas @ 100° pdt 30 min ...mais je pense que j'ai fait un mauvais étalement parceque les mitoses apparaissent superposées et je trouve des difficulté pour classer .....merci bcpppp pour tous